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凝膠遷移實(shí)驗(yàn)點(diǎn)擊次數(shù)：4886 更新時(shí)間：2012-05-29
凝膠遷移實(shí)驗(yàn)
凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中,全面詳細(xì)地介紹具體的實(shí)驗(yàn)操作方法,從探針的標(biāo)記,探針的純化,EMSA膠的配制,EMSA結(jié)合反應(yīng),再到zui后的電泳分析. www.biomart.cn/runwell/index.htm
1.探針的標(biāo)記
（1） 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：
待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升
總體積 10微升
按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻.
（2） 使用水浴或PCR儀,37℃反應(yīng)10分鐘.
（3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液,混勻,終止探針標(biāo)記反應(yīng).
（4） 再加入89微升TE,混勻.此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率.通常標(biāo)記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上.為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn),通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率.
（5） 標(biāo)記好的探針立即使用,zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天.標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃.
2.探針的純化
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn),可以不必純化標(biāo)記好的探針.在有些時(shí)候,純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果.如需純化,可以按照如 下步驟操作：
（1） 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針,加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無(wú)水乙醇,混勻.
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí),或在-20℃沉淀過(guò)夜.
（3） 在4℃,12000g-16000g離心30分鐘.小心去除上清,切不可觸及沉.
（4） 在4℃,12000g-16000g離心1分鐘.小心吸去殘余液體.微晾干沉淀,但不宜過(guò)分干燥.
（5） 加入100微升TE,*溶解沉淀.標(biāo)記好的探針立即使用,zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天.標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃.
3.EMSA膠的配制
（1） 準(zhǔn)備好倒膠的模具.可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具,或其它適當(dāng)?shù)哪＞?選擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續(xù)操作.為得到更好的結(jié)果,可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具.
（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大）.
TBE buffer （10X） 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%,w/v） 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 過(guò)硫酸銨 （ammonium persulfate） 150微升
TEMED 10微升
（3） 按照上述次序加入各個(gè)溶液,加入TEMED前先混勻,加入TEMED后立即混勻,并馬上加入到制膠的模具中.避免產(chǎn)生氣泡, 并加上梳齒.如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡,可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理.
4.EMSA結(jié)合反應(yīng)www.nhome100.com
（1） 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：
陰性對(duì)照反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 0微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
樣品反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的突變探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
Super-shift反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
目的蛋白特異抗體 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
（2） 按照上述順序依次加入各種試劑 ,在加入標(biāo)記好的探針前先混勻,并且室溫（20-25℃）放置10分鐘,從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合,或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng).然后加入標(biāo)記好的探針,混勻,室溫（20-25℃）放置20分鐘.
（3） 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無(wú)色,10X）,混勻后立即上樣.注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合,建 議盡量使用無(wú)色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液.如果對(duì)于使用無(wú)色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺(jué)到無(wú)法上樣,可以在無(wú)色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液,至能觀察到藍(lán)顏色即可.
5. 電泳分析
（1） 用0.5XTBE作為電泳液.按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘.預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍(lán)色）,以觀察電壓是否正常進(jìn)行.
（2） 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi).在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（藍(lán)色）,用于觀察電泳進(jìn)行的情況.
（3） 按照10V/厘米的電壓電泳.確保膠的溫度不超過(guò)30℃,如果溫度升高,需要適當(dāng)降低電壓.電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處,停止電泳.
（4） 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙.小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液.小心打開(kāi)兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板）,把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊.濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘）,輕輕揭起濾紙,這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來(lái).把濾紙側(cè)向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒(méi)有氣泡.
（5） 干膠儀器上干燥EMSA膠.然后用X光片壓片檢測(cè),或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè).
（1） 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：
待標(biāo)記探針 （1.75pmol/微升） 2微升
T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升
Nuclease-Free Water 5微升
[γ-32P]ATP（3,000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升
T4 Polynucleotide Kinase （5-10U/微升） 1微升
總體積 10微升
按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻.
（2） 使用水浴或PCR儀,37℃反應(yīng)10分鐘.
（3） 加入1微升探針標(biāo)記終止液,混勻,終止探針標(biāo)記反應(yīng).
（4） 再加入89微升TE,混勻.此時(shí)可以取少量探針用于檢測(cè)標(biāo)記的效率.通常標(biāo)記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上.為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn),通常不必測(cè)定探針的標(biāo)記效率.
（5） 標(biāo)記好的探針立即使用,zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天.標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃.
2.探針的純化
通常為實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便起見(jiàn),可以不必純化標(biāo)記好的探針.在有些時(shí)候,純化后的探針會(huì)改善EMSA的電泳結(jié)果.如需純化,可以按照如 下步驟操作：
（1） 對(duì)于100微升標(biāo)記好的探針,加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無(wú)水乙醇,混勻.
（2） 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí),或在-20℃沉淀過(guò)夜.
（3） 在4℃,12000g-16000g離心30分鐘.小心去除上清,切不可觸及沉.
（4） 在4℃,12000g-16000g離心1分鐘.小心吸去殘余液體.微晾干沉淀,但不宜過(guò)分干燥.
（5） 加入100微升TE,*溶解沉淀.標(biāo)記好的探針立即使用,zui長(zhǎng)使用時(shí)間一般不宜超過(guò)3天.標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃.
3.EMSA膠的配制
（1） 準(zhǔn)備好倒膠的模具.可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具,或其它適當(dāng)?shù)哪＞?選擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續(xù)操作.為得到更好的結(jié)果,可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具.
（2） 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠（注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對(duì)結(jié)果影響不大）.
TBE buffer （10X） 1毫升
重蒸水 16.2毫升
39:1 acrylamide/bisacrylamide （40%,w/v） 2毫升
80% 甘油 625微升
10% 過(guò)硫酸銨 （ammonium persulfate） 150微升
TEMED 10微升
（3） 按照上述次序加入各個(gè)溶液,加入TEMED前先混勻,加入TEMED后立即混勻,并馬上加入到制膠的模具中.避免產(chǎn)生氣泡, 并加上梳齒.如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡,可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理.
4.EMSA結(jié)合反應(yīng)www.nhome100.com
（1） 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：
陰性對(duì)照反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 7微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 0微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
樣品反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 5微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
探針冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
突變探針的冷競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
未標(biāo)記的突變探針 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
Super-shift反應(yīng)：
Nuclease-Free Water 4微升
EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X） 2微升
細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升
目的蛋白特異抗體 1微升
標(biāo)記好的探針 1微升
總體積 10微升
（2） 按照上述順序依次加入各種試劑 ,在加入標(biāo)記好的探針前先混勻,并且室溫（20-25℃）放置10分鐘,從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合,或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng).然后加入標(biāo)記好的探針,混勻,室溫（20-25℃）放置20分鐘.
（3） 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（無(wú)色,10X）,混勻后立即上樣.注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會(huì)影響蛋白和DNA的結(jié)合,建 議盡量使用無(wú)色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液.如果對(duì)于使用無(wú)色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺(jué)到無(wú)法上樣,可以在無(wú)色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液,至能觀察到藍(lán)顏色即可.
5. 電泳分析
（1） 用0.5XTBE作為電泳液.按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘.預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液（藍(lán)色）,以觀察電壓是否正常進(jìn)行.
（2） 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi).在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液（藍(lán)色）,用于觀察電泳進(jìn)行的情況.
（3） 按照10V/厘米的電壓電泳.確保膠的溫度不超過(guò)30℃,如果溫度升高,需要適當(dāng)降低電壓.電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處,停止電泳.
（4） 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙.小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液.小心打開(kāi)兩塊膠板中的上面一塊（注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板）,把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊.濾紙被膠微微浸濕后（大約不足1分鐘）,輕輕揭起濾紙,這時(shí)EMSA膠會(huì)被濾紙一起揭起來(lái).把濾紙側(cè)向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒(méi)有氣泡.
（5） 干膠儀器上干燥EMSA膠.然后用X光片壓片檢測(cè),或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測(cè).
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